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pcr如何定量

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用MX-3000做荧光定量PCR,我的质粒用SYBR染料做标准曲线,为什麽CT值总在28-30之间,扩增效率都800以上了,做标准曲线老做不出来,质粒都重复稀释好多次了,我从1ng每微升到1fg每微升稀释7个梯度,最小ct值老是在26以上,间隔也很小,都在0.4左右,且没规律,急求好心人帮忙。 , 标准化和归一化是一样的吗,还需要有其他的校正吗 ...

定量pcr中的ΔRn值指的是什么啊?:

ΔRn = R+n - R-n ,计算ΔRn ,其中, R+n 是表示每点测量的荧光强度, R-n 表示荧光基线强度

实时荧光定量PCR是利用荧光信号的变化,实时检测PCR扩增反应中每次循环扩增产物量的变化,通过循环阈值和标准曲线的分析对标本中起始模板拷贝数进行定量分析。

扩展资料:

特点

实时荧光定量PCR由于荧光物质的应用,可以通过光电传导系统直接探测PCR扩增过程中荧光信号的变化以获得定量结果,克服了常规PCR的许多缺点,具有如下优势:

①能对模板定量;

②封闭反应,无需PCR后处理,污染少,假阳性率低;

③观察和记录自动化,结果直观,避免人为判断带来的误差;

④工作效率高,利于实现高通量检测。

实时荧光定量PR的缺点表现:

①需要特殊设备以及荧光探针,成本较高;

②不能显示PCR产物的片段长度;

③定量准确性还有待提高。

参考资料来源:百度百科-定量PCR

定量PCR ct值在多少范围适合: 通常情况下,我们认定为15到35CT比较合理,超过35个CT那么就算它没有扩增了,如果15之前起峰,那么就是模板浓度太高所引起的,如果发文章,那么建议你控制在15到35之间吧

PCR荧光定量: 间隔也很小,都在0.4左右-----估计你没有扩出目的DNA片段,检测到的信号都是引物二聚体跟SYBR结合的结果。

我怀疑你的PCR条件还没调整至最佳条件。你先用浓度最大的那个质粒做模板,进行定性PCR,然后跑电泳,观察是否有目的条带,是否有引物二聚体。记住,有引物二聚体的话,引物二聚体就会和SYBR结合,这样做realtimePCR是不准的。一定要调整至没有引物二聚体,可以考虑提高退火温度及降低引物浓度。
调整好之后,质粒用PCR水做10倍梯度稀释(比如4微升稀释至40微升),如果扩增效率没问题的话,理论上质粒浓度每差10倍,其ct值就相差3.3。另外,如果体系调整好之后,你的质粒最小的还是在26以上的话,最低只能稀释到100倍了,再低就做不出来了

实时荧光定量pcr两步法与三步法的异同是什么?如何选择使用: 我觉得还是看你用的机器和试剂盒吧,主要是那个聚合酶的要求.有的推荐两步法,有的推荐三步法.比如,ABI,roche都推荐两步法,tiangen的推荐三步法.我觉得,如果引物设计时的Tm值如果接近60度

怎样减少做荧光定量PCR时的加样误差: 1)用进口的枪头,以免挂壁的残液太多。

2)增大模版的上样体积(将模版稀释),每个反应中模版的体积不要小于5ul,

荧光定量PCR的优缺点: 荧光定量PCR是比较定性更加规范,有数字说话,自己判断。但是,也有出现假阳性的现象。

如何使用强悍的ENSEMBL和IDT设计实时定量PCR的引物: 定量PCR引物设计软件很多,NCBI Primer blast、Real time PCR primer database也很多

定量PCR数据分析中,标准化和归一化是怎样进行的 用内参基因标准化时为什么要用几何平均 谢谢: 归一化,就是一般把对照组的基因表达水平设为一,实验组的变化则表达为对照组的倍数。标准化也是一个意思。均数的计算参见我对你另外几个问题的回答。有具体问题再问。

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